Клетчатка в питании. Тридцать шесть искусных ткачих Биосинтез целлюлозы

Клеточная стенка образуется в результате развития срединной пластинки. Сразу после полного разделения ядра растительной клетки в телофазе митоза поперек делящейся клетки образуется фрагмопласт. Он состоит из множества уплощенных мембранных везикул - фрагмосом, содержащих компоненты кле­точной стенки. В их построении участвует цитоскелет. Все полисахариды кле­точной стенки, за исключением целлюлозы, синтезируются в аппарате Гольд-жи. Они упаковываются в везикулы, которые транспортируются к растущей

срединной пластинке и сливаются с ней. Срединная пластинка увеличивается по направлению к плазмалемме и соединяется с ней, разделяя две дочерние клетки. Наконец, вновь образующаяся клеточная стенка соединяется с уже существующей первичной клеточной стенкой.

Практически все «нецеллюлозные» компоненты клеточной стенки - поли­сахариды, структурные белки, широкий спектр ферментов - образуются в аппарате Гольджи и в его везикулах координированно направляются к клеточной стенке.

До сих пор не идентифицированы гены, кодирующие полисахаридсинтазы, участвующие в синтезе основных цепей «нецеллюлозных» полимеров. Иденти­фицированы гены нескольких фукозил- и галактозилтрансфераз, которые при­соединяют отдельные сахара к главной цепочке.

Единственными полимерами, которые синтезируются с внешней стороны плазмалеммы, являются целлюлоза и каллоза. Целесообразность этого становится очевидной, если принять во внимание большую длину образующихся микрофибрилл целлюлозы и необходимость их филигранной укладки в кле­точную стенку. Каллоза отличается от целлюлозы наличием β 1 → 3-D-глюкано-вых цепочек, которые могут образовывать спиральные дуплексы и триплексы. Каллоза образуется в нескольких типах клеток на определенных стадиях фор­мирования клеточной стенки, например в прорастающей пыльцевой трубке или срединной пластинке делящихся клеток. Каллоза может также синтезиро­ваться при стресс-реакциях или в ответе на грибную инфекцию.

Синтез целлюлозы катализируется мультимерными комплексами фермен­тов, расположенными на концах удлиняющихся микрофибрилл целлюлозы. Эти терминальные комплексы хорошо различимы под электронным микроскопом.

Рис. 1.30. Схема строения и работы целлюлозосинтазы

В некоторых морских водорослях терминальные комплексы синтеза целлюлозы расположены линейно; у всех покрытосеменных растений они фор­мируют розеточные структуры. Терминальные комплексы появляются в мемб­ране плазмалеммы в момент активации синтеза целлюлозы.

Исходным субстратом для целлюлозосинтазы является УДФ-глюкоза. Она образуется с помощью фермента сахарозосинтазы непосредственно из сахаро­зы. Ряд изоформ этого фермента находятся в плазматической мембране. Они ассоциированы с целлюлозосинтазой и могут поставлять УДФ-глюкозу непо­средственно к ее каталитическому центру (рис. 1.30).

Относительно недавно были идентифицированы несколько растительных генов, кодирующих ферменты синтеза целлюлозы, в частности гены CesA, которые интенсивно экспрессируются в хлопковых волокнах во время актив­ного синтеза целлюлозы вторичной клеточной стенки. Кодируемые этими ге­нами полипептиды имеют восемь трансмембранных доменов и массу около 110 кДа. Открытие генов CesA дало возможность идентифицировать ряд других генов, кодирующих синтазы полисахаридов клеточной стенки.

Гемицеллюлозы, состоящие в основой из безводных остатков D-ксилозы, широко распространены в растительном царстве как компоненты клетки. Часто их рассматривают в качестве веществ, цементирующих ткани растения. Были исследованы гемицеллюлозы, выделенные из соломы, листьев, отрубей, эндосперма и зародыша пшеницы Triticum vulgare.

Синтез целлюлозы и пентозанов в растении недостаточно изучен. Гипотеза о том, что пентозаны образуются непосредственно из гексоз в результате окислительного декарбоксилирования, получила поддержку в работах Кострубина, который показал, что содержание свободных фруктозы и фруктозанов в стебле пшеницы уменьшается по мере усиления процессов лигнификации и возрастания количества гемицеллюлозы. Путем подкормки растущих растений пшеницы простыми сахарами, меченными С14, Нейш установил, что предшественником как целлюлозы, так и ксилозы является глюкоза. Распределение С14 указывает, что главным путем синтеза ксилана является отщепление углерода от глюкозы в положении 6 и что пентозы превращаются в ксилан только при образовании в качестве промежуточного соединения глюкозы.

Внешний вид выделенных гемицеллюлоз зависит в основном от метода извлечения. При наличии заметных количеств воды и высушивании образца на воздухе полученный продукт обычно представляет твердую, роговидную массу янтарного цвета, с трудом поддающуюся диспергированию или растворению. В том случае, когда образец высушивался с помощью растворителей с постепенно уменьшающейся полярностью, как правило, получали порошки белого цвета. При лиофильном высушивании очень разбавленных водных дисперсий гемицеллюлозы выделяли продукты с наименьшей плотностью и наибольшей растворимостью.

При гидролизе гемицеллюлозы и пентозаны дают производные пентоз и гексоз. Мономерными единицами, чаще всего встречающимися в пентозанах и гемицеллюлозах злаков, являются пентозосахара D-ксилоза и L-арабиноза. Кроме того, имеются данные о наличии некоторых гексозо-сахаров и их производных. К ним относятся D-галактоза, D-глкжоза, D-глюкуроновая кислота и 4-О-метил-1)-глюкуроновая кислота. В общем гемицеллюлозы и пентозаны, выделяемые из хлебных злаков и трав, характеризуются присутствием остатков L-арабофуранозы, соединенных в виде боковой цепи из единственного остатка с основной цепью из D-ксилопиранозных остатков. Обычно боковые цепи присоединяются в положении третьего остатка D-ксилозы, однако в некоторых случаях остатки D-глюкуроновой кислоты или 4-О-метил-глюкуроновой кислоты могут присоединяться в положении 2 или 3.

В своем обзоре, посвященном растительным гумми, Херст установил, что большинство этих гумми и растительных слизей обладает сильно разветвленной структурой, при которой гидроксильные группы расположены идеально для связывания молекул воды. Вследствие этого даже в наиболее концентрированных растворах гумми остаются сильно гидра — тированными. Тем не менее должны существовать межмолекулярные водородные связи между самими молекулами гумми, которые в сильно разбавленных растворах не проявляются достаточно сильно, но с удалением воды обнаруживают тенденцию к образованию структуры возрастающей жесткости. Возможно, что характерные физические свойства гумми и растительных слизей объясняются каким-то тонким взаимодействием между этими противоположными реакциями.

При получении и выделении углеводов из растительных тканей ферменты могут осуществлять их случайное расщепление или вызывать модификацию. Опыты на непроросших пшенице и ячмене показали, что встречающиеся в естественных условиях ферменты могут разрушать межмолекулярные связи молекулы пентозана, что приводит к быстрому снижению вязкости, сопровождающемуся медленным образованием свободных восстанавливающих групп. Это действие ферментов усиливается при прорастании зерна. Изменение соотношения между ксиланом и арабаном в пентозане изменяет его растворимость и может вызвать также растворение первоначально не растворяющихся в воде гемицеллюлоз. Хотя атакуемость пентозанов пентозаназами часто облегчает выделение некоторых компонентов клеточных стенок, а также клейковины и крахмала, остается непреложным фактом необходимость соблюдения определенных предосторожностей, чтобы в процессе получения гемицеллюлоз и пентозанов избежать их ферментативного расщепления.

1

Изучен процесс биосинтеза бактериальной целлюлозы (БЦ) на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала мискантуса. Лигноцеллюлозный материал получен обработкой мискантуса разбавленным раствором азотной кислоты на опытном производстве. Ферментативный гидролиз осуществлён в ферментере объёмом 11 л. Биосинтез БЦ проведён с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12. Установлено, что численность уксуснокислых бактерий в процессе культивирования в 1,2 раза меньше, чем дрожжей. Основная утилизация субстрата происходит за 6 суток культивирования, константа утилизации субстрата составляет 0,234 сут-1. Показано, что ферментативный гидролизат лигноцеллюлозного материала мискантуса не является доброкачественной питательной средой для биосинтеза БЦ, выход БЦ составил 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход на синтетической питательной среде. Установлено, что бактериальная целлюлоза, полученная на данной среде, является химически чистой.

бактериальная целлюлоза

Мedusomyces gisevii

инфракрасная спектроскопия

ферментативный гидролизат

мискантус

1. Бактериальная целлюлоза, синтезируемая Gluconacetobacter hansenii, для использования в медицине / Т.И. Громовых и [др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2017. – Т. 53, № 1. – С. 69–75.

2. Перспективы применения бактериальной целлюлозы в мясопродуктах / Т.И. Громовых и [др.] // Мясная Индустрия. – 2013. – № 4. – C. 32–35.

3. Octave S. Biorefinery: toward an industrial metabolism / S. Octave, D. Thomas // Biochimie. – 2009. – № 91. – P. 659–664.

4. Gismatulina Y.A., Budaeva V.V., Sakovich G.V., Veprev S.G., Shumny V.K. Cellulose from various parts of soranovskii miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. – 2015. – Vol. 5, № 1. – Р. 60–68.

5. Гисматулина Ю.А. Сравнение физико-химических свойств целлюлоз, полученных комбинированным способом из листа и стебля мискантуса / Ю.А. Гисматулина / Вестник алтайской науки. – 2014. – № 1 (19). – С. 302–307.

6. Макарова Е.И. Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК: дис. … канд. технич. наук. – Щелково, 2015. – 161 с.

7. Гладышева Е.К. Особенности структурных характеристик бактериальной целлюлозы, синтезированной на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала плодовых оболочек овса / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба, Л.А. Алешина // Ползуновский вестник. – 2016. – № 4–1. – С. 152–156.

8. Skiba E.A., Budaeva V.V., Baibakova O.V., Udoratina E.V., Shakhmatov E.G., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Materials in Aqueous Media and the Subsequent Microbiological Synthesis of Bioethanol // Catalysis in Industry. – 2016. – Vol. 8, № 2. – Р. 168–175.

9. Cкиба Е.А. Методика определения биологической доброкачественности гидролизатов из целлюлозосодержащего сырья с помощью штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1693 / Е.А. Cкиба // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2016. – № 1 (16). – С. 34–44.

10. Гладышева Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2015. – № 3. – С. 149–156.

11. Гладышева Е.К. Исследование влияния температуры на синтез бактериальной целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева // Современные наукоемкие технологии. – 2016. – № 8–1. – С. 36–40.

12. Юркевич Д.И. Медузомицет (Чайный гриб): научная история, состав, особенности физиологии и метаболизма / Д.И. Юркевич, В.П. Кутышенко // Биофизика. – 2002. – № 6. – С. 1116–1129.

13. Yang, X.-Y., Huang C., Guo H.-J., Xiong L., Li Y.-Y., Zhang H.-R., Chen X.-D. Bioconversion of elephant grass (Pennisetum purpureum) acid hydrolysate to bacterial cellulose by Gluconacetobacter xylinus // Journal of Applied Microbiology. – 2013. – № 115. – Р. 995–1002.

14. Яровенко В.Л. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов. – М.: Колос, 1999. – 464 с.

15. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Ч. ΙΙ. – СПб.: НПО «Профессионал», 2006. – 1142 с.

Масштабирование процесса и реализация на практике биотехнологического производства зависит от таких факторов, как наличие воспроизводимого массового дешевого сырья; простота трансформации сырья в питательную среду; возможность аппаратурного оформления производства стандартным либо новым эффективным оборудованием; высокий выход целевого продукта и обеспечение стандартности его качества. Ввиду перспективности использования БЦ в различных областях необходимо создание ее промышленного производства, при этом важной задачей является поиск подходящих источников углерода, имеющих низкую стоимость и не конкурирующих с пищевой продукцией. Актуальным направлением получения БЦ является использование целлюлозосодержащего сырья для получения из него альтернативных питательных сред.

Массовое использование ископаемых ресурсов в течение прошлого столетия и связанная с этим проблема загрязнения вызвали значительное число экологических и экономических проблем. Предположительно, эти ресурсы будут исчерпаны в ближайшем будущем. Данные причины способствуют прогрессивному переходу к экономике на основе возобновляемых материалов (биомассы) в качестве сырья для производства химических веществ, материалов, топлива и энергии в пределах так называемой концепции биоконверсии. Целлюлоза является одним из наиболее распространенных полисахаридов и рассматривается как неисчерпаемый и универсальный источник. Перспективным является использование так называемых энергетических, т.е. быстрорастущих растений: мискантуса, проса, сорго и т.д. . Мискантус - род многолетних травянистых растений семейства мятликовых. Представляет растение высотой до 200 см, стебли прямостоячие, листья простые пластинчатой формы, верхушка острая, основание клиновидное, соцветия в виде метелок. Растение является многолетним злаком и начиная с третьего года культивирования может ежегодно продуцировать на одном поле на протяжении 15-20 лет 10-15 т/га/год сухой биомассы, что соответствует 4-6 т/га чистой целлюлозы .

В ИПХЭТ СО РАН разработана технология получения ферментативных гидролизатов из мискантуса. Предварительно мискантус подвергают химической обработке разбавленными растворами кислоты и/или щелочи , а затем ферментативному гидролизу . Исследование процесса биосинтеза БЦ на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала плодовых оболочек овса показало, что для успешного микробиологического синтеза ферментативный гидролизат должен обладать биологической доброкачественностью.

В данной работе в качестве субстрата для ферментативного гидролиза выбран лигноцеллюлозный материал (ЛЦМ) мискантуса. ЛЦМ мискантуса получают обработкой сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты при атмосферном давлении в стандартном оборудовании. Показано, что ферментативный гидролизат, полученный из ЛЦМ мискантуса, является биологически доброкачественным для биосинтеза этанола и не нуждается в дополнительной технологической обработке для освобождения его от вредных примесей .

Целью данной работы являлось изучение процесса биосинтеза БЦ на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса и исследование структуры полученных образцов методом инфракрасной спектроскопии. Следует отметить, что данная задача неоднозначна, поскольку продуценты БЦ более требовательны к составу питательных сред, следовательно, данные по доброкачественности среды для дрожжей не могут быть экстраполированы на целлюлозосинтезирующие микроорганизмы .

Материалы и методы исследования

ЛЦМ мискантуса был получен обработкой разбавленным раствором азотной кислоты на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН и имел следующий состав (%, в пересчете на а.с.в.): массовая доля кислотонерастворимого лигнина - 10,6, массовая доля золы - 4,8, массовая доля целлюлозы по Кюршнеру - 86,7, массовая доля пентозанов - 7,9.

Ферментативный гидролиз ЛЦМ мискантуса проводился в ферментере объёмом 11 л в водной среде при 47 ± 2 °С в течение 72 ч с помощью ферментных препаратов Целлолюкс-А (0,04 г/г субстрата) и Брюзайм BGX (0,1 мл/г субстрата), активная кислотность поддерживалась на уровне 4,7 ± 0,2 с помощью гидроксида аммония и ортофосфорной кислоты, начальная концентрация субстрата составила 60 г/л, более подробно методика описана в работе .

Полученный ферментативный гидролизат отфильтровывался от остатков субстрата под вакуумом. Гидролизат представлял собой прозрачную жидкость рыжего цвета с кислым запахом, активная кислотность 4,7 ед. рН. Общее количество редуцирующих веществ (РВ) составило 49,0 г/л, из них ксилозы - 2,8 г/л. В отфильтрованный ферментативный гидролизат ЛЦМ из мискантуса вносился охлажденный настой чая (1 л дистиллированной воды доводили до кипения, добавляли сухой черный байховый чай, проводили экстракцию в течение 15 мин, охлаждали и отфильтровывали). При этом питательная среда стандартизовалась по содержанию РВ от 20 до 25 г/л и по содержанию экстрактивных веществ чая от 1,6 г/л до 4,8 г/л .

В качестве продуцента для биосинтеза БЦ использовалась симбиотическая культура Мedusomyces gisevii Sa-12. Предварительно проводилась адаптация культуры на исследуемой питательной среде. Инокулят вносился в питательные среды в количестве 10 % от объема питательной среды, культивирование проводилось в статических условиях при 27 °С в течение 24 суток. Условия культивирования выбраны на основании ранее проведённых работ .

Микробиологические показатели (количество дрожжей и уксуснокислых бактерий) контролировались с использованием микроскопа B-150 OPTIKA. Прирост пленки БЦ оценивался гравиметрическим методом (весы лабораторные аналитические Explorer EX-224), уровень активной кислотности контролировался с помощью иономера (иономер И-160 МИ). Концентрация РВ контролировалась спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO-2804», США) с использованием динитросалицилового реактива, концентрация ксилозы определялась по стандартной методике, которая основана на образовании фурфурола из пентозанов.

Структура бактериальной целлюлозы была исследована на инфракрасном спектрофотометре «Инфралюм ФТ-801» в таблетках KBr.

Результаты исследования и их обсуждение

Изменение количества дрожжей и уксуснокислых клеток в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса представлено на рис. 1, изменение уровня активной кислотности в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 - на рис. 2.

Концентрация клеток дрожжей в питательной среде в процессе культивирования оказалась на порядок выше, чем уксуснокислых бактерий. Для дрожжей лаг-фаза не наблюдалась, увеличение концентрации клеток происходило с 0 по 12 сутки, после 12 суток происходила фаза отмирания. Для уксуснокислых бактерий наблюдалась лаг-фаза, до 8 суток их количество увеличивалось, с 8 по 10 сутки количество клеток оставалось постоянным, после 10 суток происходила фаза отмирания.

Рис. 3. Зависимость концентрации РВ и выхода БЦ от продолжительности культивирования

В процессе культивирования симбиотической культуры Мedusomyces gisevii в питательной среде в результате действия защитного механизма накапливаются промежуточные продукты гликолиза: уксусная, глюконовая кислоты, этанол и глицерин , косвенно об их накоплении можно судить по изменениям рН. Начальная активная кислотность питательной среды составляла 4,0, до шестых суток культивирования значение pH понизилось до 3,8. Далее в процессе культивирования значение активной кислотности среды повышалось до 5,9. Повышение активной кислотности не характерно для данного продуцента, однако похожая зависимость описана при культивировании продуцента Gluconacetobacter xylinus CH001 на кислотном гидролизате мискантуса .

На рис. 3 представлена зависимость концентрации РВ и выхода БЦ от продолжительности культивирования.

Константа скорости утилизации субстрата рассчитана по формуле :

где Ку.с. - константа утилизации субстрата, сут-1; S1, S2 - концентрация РВ в начальный и конечный моменты времени; t1, t2 - начальный и конечный моменты времени, сутки.

Рис. 4. Ик-спектр образца БЦ

Утилизация субстрата происходила в два периода: с 0 по 6 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,234 сут-1, со 6 по 24 значение снизилось в 12 раз и составило 0,020 сут-1. Быстрая утилизация РВ с 0 по 6 сутки связано с потреблением субстрата микроорганизмами и их активным размножением. Со 6 по 24 сутки РВ медленно расходуются на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов.

Гидролизат ЛЦМ мискантуса преимущественно состоит из глюкозы, концентрация ксилозы в нулевой момент времени составила 1,2 г/л. На 7 сутки культивирования общая концентрация РВ составила 4,9 г/л, при этом количество ксилозы в гидролизате практически не изменилось и составило 0,8 г/л. Через 24 суток культивирования концентрация РВ в питательной среде составила 3,4 г/л, а ксилозы - 0,3 г/л.

Скорость синтеза продукта (бактериальной целлюлозы) рассчитана по формуле

где Кс.п. - константа синтеза продукта, сут-1; С1, С2 - масса продукта в начальный и конечный момент времени; t1, t2 - начальный и конечный моменты времени, сутки.

В первые сутки культивирования на поверхности питательной среды не наблюдалось четко выраженной гель-пленки БЦ. На вторые сутки культивирования образовалась тонкая гель-пленка БЦ. Основной прирост биомассы происходил с 2 по 6 сутки культивирования - выход БЦ увеличился с 1,1 % до 4,7 %; константа скорости синтеза продукта в этот период составила 0,363 сут-1. С 6 по 10 сутки выход БЦ вырос до 5,6 %, константа скорости синтеза продукта в этот период снизилась до 0,044 сут-1. Далее скорость синтеза БЦ снижается, стремясь к нулевому значению.

С 10 по 24 сутки выход БЦ снизился до 1 %, что указывает на идущие процессы деструкции, этот период совпадает с фазой отмирания дрожжей и уксуснокислых бактерий. Таким образом, на практике начало фазы отмирания микроорганизмов может служить критерием окончания процесса биосинтеза БЦ.

Ферментативный гидролизат ЛЦМ мискантуса не является благоприятной питательной средой для биосинтеза БЦ, наибольший выход БЦ составил 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход БЦ на синтетической питательной среде при культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 в аналогичных условиях - 9,0 % . Предположительно, это можно объяснить способом предобработки исходного сырья и присутствием примесей в ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса, которые могут ингибировать биосинтез БЦ. Таким образом, доброкачественность ферментативного гидролизата ЛЦМ мискантуса для биосинтеза этанола не является гарантией доброкачественности для биосинтеза БЦ, что обусловлено большой требовательностью к качеству питательных сред симбиотических продуцентов Мedusomyces gisevii Sa-12 по сравнению с Saccharomyces сerevisiae. Можно предположить, что для успешного биосинтеза БЦ следует использовать более чистые субстраты, например техническую целлюлозу мискантуса.

На рис. 4 представлен ИК-спектр образца БЦ, синтезированного на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса.

В инфракрасном спектре образца БЦ присутствует интенсивная полоса при 3381 см-1, которая указывает на валентные колебания OH-групп. Менее интенсивная полоса при 2917 см-1 обусловлена валентными колебаниями групп CH2, CH. В спектре БЦ полосы в диапазоне 2000-1500 см-1 принадлежат деформационным колебаниям OH-групп прочно связанной воды. Слабые полосы поглощения в диапазоне: 1430-1370 см-1 обусловлены деформационным колебаниям групп CH2; 1360-1320 см-1 - деформационные колебания групп OH в CH2OH. Полосы при 1281 и 1235 см-1 указывают на деформационные колебания OH-групп в спиртах. Полоса при 1204 см-1 указывает на деформационные колебания OH-групп. Полосы поглощения в области 1000-1200 см-1 обусловлены в основном валентными колебаниями C-O-C и C-O в спиртах . Таким образом, методом ИК подтверждено, что БЦ, полученная на ферментативном гидролизате ЛЦМ, является чистым соединением, содержащим только целлюлозу.

Исследован процесс биосинтеза БЦ симбиотической культурой Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса. Основная утилизация субстрата происходит за 6 суток культивирования, константа утилизации субстрата составляет 0,236 сут-1. Установлено, что численность уксуснокислых бактерий в процессе культивирования на порядок меньше, чем дрожжей, и через 10 суток составляет 1,1 КОЕ/мл. Показано, что на практике начало фазы отмирания симбиотических микроорганизмов может служить критерием окончания процесса биосинтеза, так как эта фаза совпадает с процессом деструкции БЦ. Показано, что ферментативный гидролизат ЛЦМ мискантуса не является доброкачественной питательной средой для биосинтеза БЦ: выход БЦ на 10 сутки культивирования составляет 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход БЦ на синтетической питательной среде, а на 24 сутки выход падает до 1,0 %, то есть БЦ подвергается деструкции. С помощью инфракрасной спектроскопии установлено, что БЦ является чистым соединением, содержащим только целлюлозу.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-19-01054).

Библиографическая ссылка

Гладышева Е.К. БИОСИНТЕЗ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ НА ФЕРМЕНТАТИВНОМ ГИДРОЛИЗАТЕ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО МАТЕРИАЛА МИСКАНТУСА // Фундаментальные исследования. – 2017. – № 9-2. – С. 290-294;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=41742 (дата обращения: 13.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

В растениях в процессе фотосинтеза образуются не только фосфорные эфиры сахаров или простые сахара, но и более сложные формы углеводов - сахароза, крахмал, клетчатка. Распад сложных форм углеводов до простых протекает тоже очень быстро. Это наблюдается, например, при прорастании семян, старении вегетативных органов и др. Образующиеся при распаде простые сахара или их фосфорные эфиры оттекают в репродуктивные органы, где из них вновь синтезируются сложные углеводы. И, наконец, в растениях очень легко идут процессы взаимных превращений углеводов.

Взаимопревращение моносахаридов проходит через фосфорные эфиры сахаров или их уридиндифосфатпроизводные (УДФ-производные). УДФ-производные сахаров представляют собой тот или иной сахар, соединенный через два остатка фосфорной кислоты с уридином, например:

Рис.1. Уридиндифосфатглюкоза

Синтез сахарозы

Сахароза является наиболее важным из образующихся в растениях лигосахаридов, в форме которого связанный углерод и энергия транспортируются по всему растению. Она состоит из α-D-глюкозного остатка в его пиранозной форме, связанного гликозидной связью с β-D-фруктозой в фуранозной форме. Поскольку аномерный углеродный атом обоих моносахаридов участвует в образовании гликозидной связи, их полуацетальные группы заблокированы и ни одно из колец не может открыться. Таким образом, сахароза – это невосстанавливающий сахар (не восстанавливает реактивы Фелинга и Бенедикта), и за исключением ее чрезвычайной чувствительности к кислотному гидролизу, она химически инертна. При нагревании с кислотами, или под действием сахаразы (инвертазы) сахароза гидролизуется, образуя инвертный сахар – смесь глюкозы и фруктозы. Сахароза хорошо растворима в воде и обладает сладким вкусом.

Сахароза используется как продукт питания, а также в производстве поверхностно-активных веществ (эфиры сахарозы с высшими кислотами). Основным источником получения сахарозы является сахарная свекла, содержащая до 23 % сахарозы, и сахарный тростник, стеб-ли которого содержат 10–18 % сахарозы. В настоящее время установлено, что сахароза синтезируется не только в хлоропластах, но и в цитоплазме фотосинтезирую-щих клеток из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата, возникшего из
дигидроксиацетонфосфата. Это вещество образуется при фотосинтезе в хлоропластах и затем поступает в цитоплазму. В нефотосинтезирующих тканях (например, в эндосперме прорастающих бобов клещевины) образование сахарозы из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата также происходит в цитоплазме клеток.

Сахароза (тростниковый, свекловичный сахар) – самый распространенный в природе дисахарид. В растениях он образуется из глюкозы и фруктозы. На первом этапе идет фосфорилирование глюкозы:

Глюкоза + АТФ → глюкоза-6-фосфат + АДФ,

затем глюкозо-6-фосфат изолируется в глюкозо-1-фосфат. Глюкозо-1-фосфат соединяется с УТФ, в результате чего отщепляется пирофосфатная кислота и образуется соединение глюкозы с уридиндифосфорной кислотой (УДФ) - уридиндифосфатглюкоза.

Одновременно идет фосфорилирование фруктозы под действием фермента фруктокиназы с участием АТФ:

фруктоза + АТФ → фруктозо-6-фосфат + АДФ.

После этого происходит взаимодействие УДФ-глюкозы с фруктозо-6-фосфатом с участием фермента сахарозофосфат-УДФ-глюкозилтрансферазы. Наконец, образовавшийся сахарозо-6-фосфат под действием фермента фосфатазы гидролизуется с образованием свободной сахарозы. Таким образом, для биосинтеза одной молекулы сахарозы необходимы 3 макроэргические фосфатные связи, эта реакция необратима. В нефотосинтезирующих тканях некоторых растений, например, в корнеплодах сахарной свеклы, клубнях картофеля и других сахароза может образоваться из свободной фруктозы:

УДФ-глюкоза + фруктоза ↔ сахароза + УДФ.

Реакция катализируется ферментом сахарозо-УДФ-глюкозилтрансферазой и в зависимости от условий может быть направлена как в сторону синтеза, так и в сторону расщепления сахарозы.

Синтез крахмала

Крахмал – запасной полисахарид растений, причем он может храниться в растении долго, или расходоваться достаточно быстро. На длительное время он запасается во многих семенах, клубнях и корневищах и используется только тогда, когда эти органы прорастают. На короткое время крахмал образуется в хлоропластах в период быстрого фотосинтеза, а в последующий темновой период он расходуется и оттекает из листьев в форме сахарозы. Крахмал всегда образуется и запасается в виде крахмальных зерен, находящихся в пластидах – хлоропластах либо амилопластах. Крахмальные зерна – это высокоорганизованные структуры, форма и размер которых очень разнообразны, но часто характерны для данного вида растения. Форма зерен может быть сферической, яйцевидной, чечевицеобразной или неправильной; размер может колебаться 1 до 100 мкм. Наиболее крупные крахмальные зерна у картофеля, а самые мелкие у риса и гречихи. Крахмальные зерна содержат до 20 % воды (из которых 10 % химически связано с крахмалом) и ряда концентрических слоев крахмала. Крахмальные зерна образуются путем наслаивания вновь образованных слоев на ранее существующие.

Содержание минеральных веществ в крахмале очень невелико – 0,2–0,7 %, они представлены в основном фосфорной кислотой. В крахмале найдены некоторые высокомолекулярные жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая и др.), содержание которых достигает 0,6 %. Крахмал представляет собой смесь двух полисахаридов – амилозы и амилопектина. Молекулы амилозы – это длинные неразветвленные цепи, содержащие от 100 до нескольких тысяч глюкопиранозных остатков, соединенных гликозидными связями. Изучение дифракции рентгеновских лучей показало, что молекулы амилозы имеют спиралевидную структуру диаметром 1,3 нм с шестью последовательными глюкозными остатками на один оборот спирали.

Молекулы амилозы растворимы в горячей воде, но образующийся раствор нестоек и затем происходит спонтанное осаждение амилозы, известное как ретроградация. Это происходит вследствие тенденции длинных и тонких амилозных молекул выстраиваться в линию рядом друг с другом и образовывать нерастворимые агрегаты с помощью водородных связей. Донором глюкозных остатков при биосинтезе амилозы может служить уридиндифосфатглюкоза-(УДФК). Для ее образования в реакционной среде необходимо наличие затравки, в качестве которой могут служить полисахариды, построенные всего лишь из 3-4 остатков глюкозы, соединенных α(1-4)-связями.

Остатки глюкозы переносятся на акцептор (затравку), где и происходит удлинение цепи. Реакция идет по схеме:

УДФГ + акцептор (Г)к -- УДФ + акцептор (Г)к + 1,

где Г - остатки глюкозы.

Фермент, катализирующий эту реакцию, называется УДФГ-крахмалглюкозилтрансферазой.

У большинства растений активным донором глюкозы является не УДФ-глюкоза, а аденозиндифосфатглкжозα(АДФГ). Реакция присоединения глюкозных остатков от АДФГ к низкомолекулярному акцептору идет аналогичным путем и катализируется ферментом АДФГ-крахмал-глюкозилтрансферазой. Синтез разветвленной молекулы амилопектина, имеющей α (1-6)-связи, происходит при помощи фермента α-глюкантрансферазы (Q-фермент). В синтезе крахмала участвуют и Д-фермент или глюкозилтрансфераза, образующий α(1-4)-связи и участвующий в образовании затравки.

Распад крахмала происходит при участии двух процессов - гидролиза и фосфоролиза.Гидролитический распад крахмала осуществляется под действием четырех ферментов класса гидролиз α-амилаза, катализирует расщепление α(1-4)-связи, причем связи разрываются беспорядочно. Конечный продукт такого распада - мальтоза, глюкоза, декстрины. Под действием β-амилазы происходит расщепление α (1-4)-связей с образованием остатков мальтозы. Фермент глюкоамилазы катализирует последовательное отщепление остатков глюкозы от молекулы крахмала. Амилопектин-1,6-глюкозидаза или R-фермент катализирует расщепление α(1-6)-связей в молекуле амилопектина, т. е. действует на точки ветвления.

Фосфоролиз - это присоединение фосфорной кислоты по месту разрыва глюкозидной связи между остатками моносахаридов в цепи полисахарида, при этом происходит образование глюкозо-1-фосфата. Эта реакция катализируется ферментомаглюконфосфорилазой, относящимся к классу трансфераз. Крахмал в растении может подвергаться очень быстрому распаду, так как ферменты распада находятся во всех органах растения.

Синтез целлюлозы

Целлюлоза не растворима в воде, она лишь набухает в ней. При кислотном гидролизе (кипячение в серной кислоте) превращается в глюкозу, при более слабом – в целлобиозу. С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что молекула целлюлозы имеет нитевидную форму. Эти нитевидные молекулы, благодаря водородным связям, соединяются пучками по 40–60 штук в мицеллу. В клеточных стенках растений мицеллы целлюлозы связаны во-дородными связями с различными гетерополисахаридами. Например, у белого клена ими являются соединенные между собой гликозидными связями ксилоглюкан, арабиногалактан, рамногалактурон. Кроме того, имеются данные о том, что в построении клеточной стенки растений принимает участие особый, богатый оксипролином гликопротеид экстензин.

Целлюлоза построена из остатков β-глюкозы. В биосинтезе целлюлозы принимает участие не свободная глюкоза, а ее ГДФ-производное - гуанозиндифосфатглюкоза при участии фермента целлюлозосинтетазы по схеме:

ГДФ - глюкоза + (глюкоза) к→ ГДФ + (глюкоза) к + 1

Распад целлюлозы идет преимущественно гидролитическим путем под действием фермента целлюлазы до дисахарида целлобиозы.

Транспорт углеводов осуществляется в виде сахарозы. В процессе фотосинтеза образуется много углеводов, и в этой связи большое значение имеет отток ассимилятов в другие части клетки из хлоропластов. Проникновение через мембрану хлоропластов фосфорилированных гексоз и сахарозы затруднено, наиболее легко через мембраны хлоропластов проникают триозофосфаты (ФГА и ФДА). Предполагается, что образующиеся сложные углеводы распадаются на триозофосфаты и в таком виде передвигаются в цитоплазму, где могут служить материалом для ресинтеза гексоз, сахарозы, крахмала.

Межклеточный паренхимный транспорт осуществляется двумя путями - по плазмодесмам (симпласту) или по свободному пространству (аппопласту). Сахароза, образовавшаяся в клетках мезофилла листа, десорбируется в аппопласт. Выходя из паренхимных клеток в аппопласт, сахароза расщепляется инвертазой на гексозы. Гексозы передвигаются по аппопласту к передаточным клеткам проводящих пучков по градиенту концентраций. При соприкосновении с передаточными клетками флоэмы они снова превращаются в сахарозу. Далее происходит загрузка ситовидных трубок, сахароза поступает против градиента концентраций, и требуется расход энергии (АТФ).

Предполагается, что сахароза преодолевает мембрану с помощью переносчика в комплексе с протоном. При этом благодаря работе Н + -АТФ-азы ионы Н + выкачиваются из клеток флоэмы, а затем поступают обратно по градиенту рН, увлекая за собой сахарозу против градиента ее концентрации. Основной транспортной формой углеводов по флоэме служит сахароза (С 12 Н 22 О 11). У некоторых видов наряду с сахарозой транспортной формой углеводов служат олигосахара (рафиноза, стахиоза), а также некоторые спирты.



Статья на конкурс «био/мол/текст»: Целлюлоза широко распространена в живой природе: ее молекулы являются самым распространенным биополимером на нашей планете. Это вещество - основной компонент растительных волокон, имеющее огромное значение как для глобальной экосистемы Земли, так и для различных областей промышленного производства. Растительные клетки долго хранили секрет биосинтеза этого полимера, но методы молекулярной генетики и биоинформатики позволили пролить свет на процессы его формирования. Статья посвящена истории открытия и исследования биосинтеза целлюлозы, а также последним результатам моделирования молекулярных комплексов растений, ответственных за биосинтез целлюлозного полимера.

Растительные волокна очень давно и прочно вошли в нашу повседневную жизнь. Мы встречаемся с ними, когда читаем газету, надеваем джинсы или садимся за свой рабочий стол. Столь разнообразные по свойствам материалы как хлопковая ткань, бумага или древесина весьма схожи по химической структуре и представляют собой растительные волокна или целлюлозу .

Исследования археологов показывают, что люди используют их со времен палеолита, а это значит, что уже более 30 тыс. лет целлюлоза была материальным носителем нашей культуры. Изобретение и широкое распространение книгопечатания дало сильный толчок в развитии человеческой цивилизации, который не обошелся без целлюлозы. Возможно, когда-нибудь мы полностью перейдем на электронные книги и журналы, но пока этого не произошло, а школьники и студенты хоть иногда пользуются бумажными учебниками и тетрадками, целлюлоза по-прежнему является важным и необходимым участником процесса накопления и передачи знаний. Но кто же те трудолюбивые «ткачихи», которые все это время изготавливали для нас растительные волокна? Что собой представляют и как работают растительные фабрики, производящие столь качественную продукцию в огромных количествах? Ответить на эти вопросы оказалось непросто.

Впервые в поле зрения ученых целлюлоза попала во второй половине 17 века, когда Роберт Гук сфокусировал свой микроскоп на препарате среза пробкового дерева (рис. 1). Тогда английский исследователь увидел сетчатую структуру среза, отдельные ячейки которой он и назвал клетками (от лат. cellula; еще не целлюлоза, но уже близко даже по звучанию слов). Сейчас мы знаем, что Гук наблюдал не сами клетки, а только перегородки между ними или, как говорят ученые, клеточные стенки .

Намного позднее, в первой половине 19 века, французский химик Ансельм Пайя анализировал химический состав перегородок, которые почти двести лет тому зарисовал Гук. Он установил, что основную их часть составляет волокнистое вещество, которое Ансельм Пайя назвал целлюлозой . Изучение структуры этого вещества показало, что оно представляет собой длинные ниточки или, точнее сказать, цепочки, состоящие из одинаковых повторяющихся звеньев, которыми являются более мелкие молекулы глюкозы. По мере накопления научных фактов, ученые обнаружили интересную закономерность, касающуюся целлюлозы. Растения способны синтезировать целлюлозу и откладывать ее в составе оболочек собственных клеток, а животные же никогда (если быть совсем точным, то за очень редким исключением) не образуют этот полимер. Целлюлоза оказалась таким веществом, которое кардинальным образом отличает растения от животных.

По мере развития биологии ученых уже интересовали не только вопросы описания живых организмов, их формы, окраски, но и то, как они функционируют, почему имеют ту или иную окраску, какими процессами это обеспечивается и как они протекают в клетках живых организмов. К середине 20-го века ученым стало ясно, что если в растениях или животных присутствует какое-либо вещество, то, значит, есть биохимическая реакция, в которой это вещество синтезируется, и фермент, обеспечивающий эту реакцию. Исследователи приступили к изучению метаболизма живых организмов.

В изучении метаболизма целлюлозы ничего не предвещало серьезных трудностей. Этот полимер устроен достаточно просто, поэтому предполагалось, что и процессы, обеспечивающие его накопление, не очень сложны. Целлюлозу рассматривали как элемент клеточной стенки растений, а саму клеточную стенку представляли как «картонную коробку» для живого содержимого клетки. Образование целлюлозы учёные представляли как процесс постепенного утолщения стенок «коробки» (что-то подобное наслоению накипи на стенках чайника, если его долго не чистить). Однако в действительности все оказалось значительно сложнее. Многочисленные попытки изучить реакцию накопления целлюлозы и выделить растительный фермент не увенчались успехом. Все большее число экспериментальных данных указывало, что при биосинтезе целлюлозы задействован целый комплекс ферментов, составляющий сложную систему. Складывалась парадоксальная ситуация - для синтеза достаточно простого, с точки зрения биохимии, вещества в живой клетке задействованы очень сложные механизмы. Эти процессы оказались настолько сложны, что до сих пор ученые не могут воспроизвести в пробирке биосинтез целлюлозы у растений, хотя многое здесь уже понятно благодаря бактериям, а также методам генетики и биоинформатики.

Как это часто бывало в науке 20 века, бактерии оказывали помощь в изучении сложных биологических процессов. Клетки этих мельчайших живых организмов устроены проще, поэтому и изучать их легче. В случае с целлюлозой микробы также сыграли немаловажную роль. Следует отметить, что в целом для бактерий не свойственно образование целлюлозы, однако некоторые виды, среди которых (рис. 2, видео), способны синтезировать это вещество .

Рисунок 2. Бактерии : колонии, образующиеся в лабораторных условиях при росте на плотных питательных средах (а ) и сложное микробное сообщество, на кухне чаще называемое чайным грибом (б ).

Видео. Биосинтез целлюлозы бактериями (видеомикроскопия в режиме реального времени)

Для клеток бактерий удалось сделать то, что не удавалось сделать для растительных клеток, а именно: выделить фермент, который синтезирует целлюлозу. Проанализировав бактериальную целлюлозосинтазу (именно так называется фермент, который синтезирует целлюлозу), ученые установили ключевой участок молекулы фермента, где происходит «нанизывание» отдельных звеньев глюкозы в длинную цепочку целлюлозы . Эта информация была очень ценной для исследователей, поскольку позволяла по аналогии с бактериальными ферментами искать похожие ферменты растений. К тому же ученые очень хорошо знали, что подавляющее число ферментов (в том числе и целлюлозосинтаза) относится к белкам, а информация о структуре всех белков записана в генах посредством генетического кода. Другими словами, можно перевести «текст» генетического кода на язык белковых ферментов, а где начинается работа с генетическими последовательностями, там генетики могут подключиться к исследованию и предложить свою помощь.

Если невозможно выделить и изучать ферменты биосинтеза целлюлозы, то можно выделить и изучать гены, которые кодируют эти ферменты. Ведь с генами работать намного проще, чем с ферментами. А если ферменты, которые изучаются, имеют особенности в своей структуре, то информация об этих особенностях записана и в соответствующих генах. Поэтому можно сравнивать не только сами ферменты и искать в них интересующие участки, но и гены, которые их кодируют. Ученые использовали информацию о структуре бактериальных генов целлюлозосинтаз для поиска их растительных аналогов. Подход генетиков принес долгожданный успех в расшифровке секретов биосинтеза целлюлозы растениями. В 1996 году группе ученых во главе с Дж. Пеар удалось идентифицировать два гена целлюлозосинтаз хлопчатника и один ген риса . Это были первые открытые растительные гены, кодирующие эти ферменты. Располагая данными о структуре растительных генов, ученые смогли перевести генетическую информацию на язык белковой последовательности фермента. В свою очередь, анализ белковых последовательностей при помощи биоинформатических алгоритмов позволил смоделировать структуру растительных целлюлозосинтаз (рис. 3).

Рисунок 3. Структура целлюлозосинтазы хлопчатника. а - схема вторичной структуры: шесть β-слоев обозначены стрелками, а тринадцать α-спиралей бочонками. б - пространственная структура молекулы: подписаны α-спирали и β-слои с числом, обозначающим их последовательность в аминокислотной цепочке белка (в направлении от N - к С -концу). α-Спирали, выделенные серым цветом , и β-слои, отмеченные желтым , входят в состав каталитического центра фермента.

Оказалось, что для появления способности к синтезу целлюлозы, шесть растительных ферментов должны объединиться вместе, а такой шестикратный комплекс, в свою очередь, должен объединиться с шестью подобными ему шестикратными комплексами. Растительная целлюлозосинтаза оказалась очень «компанейским» ферментом, который работает только в команде, составляющей в конечном итоге 36 отдельных ферментов (рис. 4).

Рисунок 4. Строение целлюлозосинтазного комплекса. а - модель структуры комплекса. Шесть отдельных ферментов образуют шестикратные комплексы, которые, в свою очередь, формируют целлюлозосинтезирующий комплекс. Каждый фермент синтезирует одну цепочку целлюлозы, которые, соединяясь вместе, формируют целлюлозную микрофибриллу. б - микрофотография внутренней поверхности оболочки растительной клетки табака, полученной с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Целлюлозосинтезирующий комплекс (в окружности) связан с микрофибриллой целлюлозы (отмечена стрелкой ). Риска: 200 нм.

Объединившись особым образом, эти тридцать шесть ферментов включаются в биологическую мембрану и только тогда начинают нанизывать отдельные звенья глюкозы в длинную цепочку целлюлозного полимера. Растительная целлюлозосинтаза - это тридцать шесть «ткачих», которые по шесть рассажены в шесть отдельных команд. Каждая ткачиха ткет свою нить - отдельную цепочку целлюлозы, - которая сплетается вместе с другими и дает упругую косичку из 36 отдельных ниточек. Такая косичка называется целлюлозной микрофибриллой . Все ткачихи должны работать слаженно, чтобы косичка получилась равномерной и без перекосов. Если каждая ниточка микрофибриллы на месте и косичка сплетена ровно, без брака, то ученые говорят о кристаллической форме целлюлозы, а если косичка где-то расплелась, растрепалась, - то это аморфная целлюлоза (рис. 5).

Рисунок 5. Структурная модель микрофибриллы целлюлозы. а - Микрофибрилла целлюлозы, состоящая из 36 целлюлозных цепочек. б - Несколько цепочек целлюлозы, образующие кристаллическую область. в - Цепочка молекулы целлюлозы, состоящая из «звеньев» глюкозы.

Хорошо сплетенная целлюлозная микрофибрилла - отличная опора для всего растения, а среди них встречаются настоящие гиганты. Хорошо уложенные «косички» целлюлозы образуют прочный и длинный опорный скелет, который надежно удерживает и многовековой дуб, и раскидистую иву. А ведь, по большому счету, эта прочность рождается благодаря стараниям тридцати шести искусных ткачих!

Исследования молекулярных комплексов, ответственных за биосинтез целлюлозы, важны и перспективны, поскольку имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. С одной стороны, исследование биосинтеза целлюлозы позволяет нам познавать процессы роста и развития растительной клетки, понять механизмы обмена информацией между клетками и окружающей средой, другими словами - узнать больше о том динамическом равновесии, называемом жизнью. А с другой стороны, исследование биологических процессов, которые лежат в основе биосинтеза целлюлозы, открывает широкие перспективы влияния на формирование растительного волокна, замены и моделирования его свойств под запросы конкретной области производства.

Литература

1. L. Sethaphong, C. H. Haigler, J. D. Kubicki, J. Zimmer, D. Bonetta, et. al.. (2013). Tertiary model of a plant cellulose synthase . . 93 , 12637-12642;
2. Monika S. Doblin, Isaac Kurek, Deborah Jacob-Wilk, Deborah P. Delmer. (2002). Cellulose Biosynthesis in Plants: from Genes to Rosettes . Plant and Cell Physiology . 43 , 1407-1420;
3. A. J. Bowling, R. M. Brown. (2008). The cytoplasmic domain of the cellulose-synthesizing complex in vascular plants . Protoplasma . 233 , 115-127;
4. Cosgrove D.J. Cell Walls: Structure, Biogenesis, and Expansion . In: Plant Physiology (2nd Edition) / ed. by Taiz L. and Zeiger E. 2006. P. 313–338.